1樓：陽光的天外飛天
方法一： 細菌轉化的方法多以mendel和higa（1970）的發現為基礎，其基本方法是用冰預冷的cacl2或多種2價陽離子等處理細菌，使之進入感受態得以轉化。 用cacl2製備新鮮或冷凍的大腸桿菌感受態細胞，常用於成批製備感受態細菌。
感受態細胞的製備和轉化中 為什麼要加兩次cacl2？cacl2為什麼要預冷
2樓：就喜歡理財
方法一： 細菌轉化的方法多以mendel和higa（1970）的發現為基礎，其基本方法是用冰預冷的cacl2或多種2價陽離子等處理細菌，使之進入感受態得以轉化。 用cacl2製備新鮮或冷凍的大腸桿菌感受態細胞，常用於成批製備感受態細菌。
為什麼擴大培養質粒要轉到感受態細胞內而不可以直接用pcr擴增？
3樓：匿名使用者
你要擴大的是質粒不是pcr片段，直接pcr哪能擴那麼大的質粒啊，而且質粒還是環形的，怎麼做pcr，所以當然是搖菌啦
4樓：蘋果是最好的
質粒是環狀dna分子是一個有生命活力的個體，如果需要大量的擴增，就必須用生物擴增法，就像一個生命體在不斷繁殖一樣，藉助感受態細胞繁殖就會越來越多。pcr屬於一種機械擴增，是機械性的將一個一個個體拼接起來，就像咱們化學合成一樣，而且他擴增的只是一個dn**段。再者，dna本來就是生命體內的東西，那肯定是，在生物體內繁育擴增，才是最有效快捷的方法。
5樓：匿名使用者
主要是效率問題， 通過菌體繁殖而進行的擴增是pcr的若干倍。
常用感受態細胞製備方法有哪些？
6樓：小灰馬
方法一：
細菌轉化的方法多以mendel和higa（1970）的發現為基礎，其基本方法是用
冰預冷的cacl2或多種2價陽離子等處理細菌，使之進入感受態得以轉化。
用cacl2製備新鮮或冷凍的大腸桿菌感受態細胞，常用於成批製備感受態細菌。本法適用於大多數大腸桿菌菌株，且迅速、重複性好。操作過程簡述如下。
1．從37℃培養16～20h的新鮮平板中挑取一個單菌落（如大腸桿菌dh52），或1ml新鮮的16～20h過夜培養物，轉到一個含有100mllb培養基的1l或500ml燒瓶中。於37℃劇烈振搖培養約2～3h（旋轉搖床200～300r/min），每隔20～30min測量od600值≈0.4。
2．在無菌條件下將細菌轉移到一個，用冰預冷的50ml聚丙烯離心管中，在冰上放置10～20min。
3．於4℃用sorvallgs2轉頭（或與其離心管相配的轉頭）以4000r/min離心10min，以**細胞。
4．倒數培養液，將管倒置1min以使最後殘留的痕量培養液流盡。 5．以10ml用冰預冷的0.1mmcacl2重懸每份沉澱，放於冰上。
6．於4℃用sorvallgs3轉頭（或與其相應的轉頭）以4000r/min離心10min，以**細胞。
7．倒出培養液，將管倒置1min以使最後殘留的痕量培養液流盡。
8．每50ml初始培養物用2ml冰預冷的0.1m cacl2重懸每份沉定，此時，可以迅速將細胞分裝成小份，液氮中冰凍，-70℃貯存備用。
9．用冷卻的無菌吸頭從每種感受態細胞懸液中各取200μl轉移到無菌的微量離心管中，每管加dna或連線反應混合物（體積≤10μl，dna≤50ng），輕輕旋轉以混勻內容物，在冰中放置30min。
10．將離心管放到預加溫到40℃的迴圈水浴中的試管架上，放置90s～2min，不要搖動試管。
11．快速將管轉移到冰浴中，使細胞冷卻1～2min。 12．每離心管加800μlsoc培養基，用水浴將培養基加溫到37℃，然後將管轉移到37℃搖床上，溫育45min使細菌復甦，並且表達質粒編碼的抗生素抗性標記基因。 13．將適當體積（每個90mm平板可達200μl）已轉化的感受態細胞轉移到含200mmol/l mgso4和相應抗生素的sob培養基上。
14．將平板置於室溫至液體被吸收。
15．倒置平皿，於37℃培養，12～16h後可出現菌落。
方法二：
cassuper one-step ***petent cell preps kit 採用一種簡單便捷的方法處理大腸桿菌，使其成為感受態細胞，便於質粒dna的轉化，可滿足一般實驗的要求。與cacl2法相比具有多種優點：使用方便，只需一步即可完成感受態細胞的製備；轉化效率略高於cacl2法，一般可達106-108cfu/μg，滿足一般實驗需要；感受態細胞製成後即可儲存於-70℃,無須加入甘油，並且經長期儲存活力無明顯下降。
準備工作：
1． 從液氮或低溫冰箱中取出的大腸桿菌凍存菌，在lb平板上劃線，37度過夜至長 出單菌落。挑形態飽滿的單菌落2個，分別接種5ml lb培養基中，37℃，250rpm， 過夜培養。
2． 次日從5ml lb培養物吸取200μl轉入50ml lb培養基中（250ml 錐形瓶），37 ℃，250rpm培養2小時，此時od600約0.4—0.5。
感受態細胞的製備：
3． 吸取1ml菌液到1.5ml離心管裡，5000rpm離心5分鐘，棄去上清。 4． 加入100μl預冷的solution a，懸浮菌體，冰浴30分鐘。
5． 此時感受態細胞已經制成可立即使用或-70℃儲存。 細胞轉化：
6． 在感受態細胞中加入100pg-10ngdna，混勻，冰浴30分鐘，然後42℃ 1分鐘熱 擊，再次冰浴2 分鐘。加入0.9ml lb 培養基，20μl solution b，37℃，振盪 培養1小時。
7． 取適當菌液（100-200μl）塗布相應抗性的平板。 8． 過夜培養約16個小時，數菌落數，計算轉化率。 補充說明：
1． 所用器具一定要清潔；
2． 操作步驟2 中培養基的裝量也是很重要的，建議裝量不要高於此值：500ml 錐形 瓶裝100ml培養基，250ml錐形瓶裝50ml培養基；
3． 在收穫菌體前半小時還可以在培養基中加入20mm的mgcl2 ，效果會更好一些； 4． 為保證細胞處於對數生長期，培養後的菌體的od值不要高於0.6； 5． 製備感受態細胞時所有操作儘量保證在冰上操作；
6． 細胞轉化操作步驟6中也可以不必進行熱擊，冰浴後直接加入新鮮lb，簡化操作 步驟，但轉化效率低於熱擊方法，適用於對轉化率要求不高的實驗。
方法三：
1、取1%大腸桿菌e.coli接種於含2ml lb培養基的試管中，37℃振盪培養過夜 2、取0.1ml過夜培養物轉種於含10ml lb培養基的三角瓶中，37℃振盪培養3h至od600=0.
3ml離心管中，冰浴10min。 4、在4℃下以4000rpm離心5min，去上清液
5、把菌體懸浮於15m1冰冷的0.1m cacl2溶液中，置冰上30min 6、然後再在4℃下以4000rpm離心10min，去上清液
7、將菌體懸浮於0.1ml cacl2溶液中，冰浴放置4-12hr備用。
方法四：
（1）將1ml過夜培養的細菌（如dh52、tg1、tm101）接種於100ml2×yt培養於500ml
燒瓶。於37℃刷烈振盪，通常≥200rpm培養的細菌密度約od550=0.2～0.5(5×107
cells/ml),需2～4h。
（2）將培養物放於冰上致冷10min，於4℃離心細菌培養物，10000rpm離心10min。 （3）棄除上清，將細菌懸浮於原始培養體積的一半（約50ml）的50mmcacl2和10mm tris·hcl（ph8.0）無菌冷凍液體中。
（4）將細菌懸浮放在冰上約5min，然後將懸浮物於4℃10000/rpm離心10min。
（5）棄上清，懸浮細菌於原始培養體積的1/15的50mmcacl和10mmtris·hcl（ph8.0）無菌冷凍中。此時的細胞是感受態細胞，即可用於轉化。
200μl分裝於無菌的1.5ml微量離心管中，貯存於-80℃冰箱中。
方法五：
tsb法（也是本人熱衷的方法） 1.藥品製備
1m mg2+
(1m mgso4 和 1m mgcl2等體積混合)，用0.22um濾膜超濾除菌。 tsb液（30ml/ 80ml菌液）（現配現用）：
peg3350 3g tryptone 0.3g yeast extract 0.15g nacl 0.
3g 2. 步驟： （1）活化菌株
（2）挑單菌落培養於5ml 的液笨培養基中
（3）取液體培養物50ul於80ml的液體培養基中進行擴大培養
（4）370
c培養3－4小時，od600在0.4－0.6 （5）離心，去上清
（6）加入20mltsb，重懸 （7）離心，去上清
（8）加入10mltsb，再加入15－20%的甘油，分裝儲存 注，整個操作過程均應在冰上進行。所用藥品均需滅菌。
轉化程式 （1）取出200μl感受態細胞慢慢使其溶化，並立即放於冰上，加入dna或連線反應混合物，dna量通常≤50mg。用手指彈打試管10次，使之混勻，然後放在冰上40～45min。 （2）將管放於42℃水浴中2min。
（3）然後每管直接加入1.0ml2×yt培養基，倒置混勻，並於37℃培養8～12h，幹浴或水浴，不需振搖。此期間使細菌生長並開始表達抗菌素。
（4）每200μl轉化混合物分別於6個2×yt瓊脂培養板上補充相應抗生素，並含有x-gal（20mg/ml）、iptg（200mg/ml）。
7樓：匿名使用者
最常用的：cacl2法。
有錢的話直接買。
8樓：蘇素
電擊法,鈣離子處理法
CaCl2製備感受態細胞轉化DNA時,低溫的目的是什麼 熱休
冰浴過程中，原來加在溶液中的鈣離子和細菌細胞膜結合，在低溫下形成液晶結構，這樣，在42度熱激下，這種液晶結構收縮，將細胞膜扯開孔道，使dna進入細菌細胞中。這就是原理。在0 4 cacl2低滲溶液中，細胞膨脹成球狀，轉化混合物中的dna形成抗dna酶的羥基 鈣磷酸複合物黏附於細胞表面，較低的溫度也降...
做感受態的菌多長時間內可以使用,處於感受態的細菌細胞有何優點
感受態細菌放在 80，一般可以放一年左右。一般認為在剛做好的頭40天轉化效率最高。感受態只能凍融一次，融化後在冰上，半小時以內使用，一小時也可以，但是效率會隨著時間延長而下降。處於感受態的細菌細胞有何優點 感受態的細胞處於最適攝取和容納外來dna的生理狀態。再者，將構建好的載體轉入感受態細胞進行表達...
感受態細胞的製備為什麼要在冰上操作
停止細菌增殖 加入金屬離子後，細胞膜低溫容易形成液晶態，轉化效率高。感受態細胞的製備時有什麼注意事項 1 培養溫度。較低的溫度培養有利於感受態的形成，這樣可以獲得較高的感受態，但太低又不實用，因而產生了 inoue 的高效感受態製備方法，它實際是利用了所有有利於感受態的文獻而得出的一 個非常理想方法...