1樓：環環哈
通常在製備大腸桿菌的感受態時，放置30分鐘，是為了讓原來的細胞在氯化鈣的作用下，變得更易接受外源dna，為了達到這種效果，就需要在冰上放置。
為什麼用cacl2溶液懸浮細胞時必須輕輕懸浮
2樓：匿名使用者
大腸桿菌感受態細胞的製備和轉化準備： 一.材料 e.
coli dh5α菌株:rˉ,mˉ,ampˉ；pbs質粒dna:購買或實驗室自制,eppendorf管.
二.裝置 恆溫搖床,電熱恆溫培養箱,臺式高速離心機,無菌工作臺,低溫冰箱,恆溫水浴鍋,製冰機,分光光度計,微量移液槍. 三.
試劑 1.lb固體和液體培養基 2.amp母液 3.
含amp的lb固體培養基:將配好的lb固體培養基高壓滅菌後冷卻至60℃左右,加入amp儲存液,使終濃度為50ug/ml,搖勻後鋪板. 4.
麥康凱培養基(maconkey agar):取52g麥康凱瓊脂,加蒸餾水1000ml,微火煮沸至完全溶解,高壓滅菌,待冷至60℃左右加入amp儲存液使終濃度為50ug/ml,然後搖勻後塗板. 5.
0.05mol/l cacl2溶液:稱取0.
28g cacl2(無水,分析純),溶於50ml重蒸水中,定容至100ml,高壓滅菌. 6.含15%甘油的0.
05mol/l cacl2:稱取0.28g cacl2(無水,分析純),溶於50ml重蒸水中,加入15ml甘油,定容至100ml,高壓滅菌.
操作步驟： 一、 受體菌的培養 從lb平板上挑取新活化的e.coli dh5α單菌落,接種於3-5ml lb液體培養基中,37℃下振盪培養12小時左右,直至對數生長後期.
將該菌懸液以1:100-1:50的比例接種於100ml lb液體培養基中,37℃振盪培養2-3小時至od600 ＝0.
5左右.
二、 感受態細胞的製備 ( cacl2 法) 1、將培養液轉入離心管中,冰上放置10分鐘,然後於4℃下3000g離心10分鐘. 2、 棄去上清,用預冷的0.05mol/l的cacl2 溶液10ml輕輕懸浮細胞,冰上放置15-30分鐘後,4℃下3000g離心10分鐘.
3、棄去上清,加入4ml預冷含15%甘油的0.05mol/l的cacl2 溶液,輕輕懸浮細胞,冰上放置幾分鐘,即成感受態細胞懸液. 4、 感受態細胞分裝成200μl的小份,貯存於-70℃可儲存半年.
三、 轉化 1、從-70℃冰箱中取200μl感受態細胞懸液,室溫下使其解凍,解凍後立即置冰上. 2、 加入pbs質粒dna溶液(含量不超過50ng,體積不超過10μl),輕輕搖勻,冰上放置30分鐘後. 3、42℃水浴中熱擊90秒或37℃水浴5分鐘,熱擊後迅速置於冰上冷卻3-5分鐘.
4、向管中加入1ml lb液體培養基(不含amp),混勻後37℃振盪培養1小時,使細菌恢復正常生長狀態,並表達質粒編碼的抗生素抗性基因(ampr ). 5、將上述菌液搖勻後取100μl 塗布於含amp的篩選平板上,正面向上放置半小時,待菌液完全被培養基吸收後倒置培養皿,37℃培養16-24小時. 同時做兩個對照:
對照組1:以同體積的無菌雙蒸水代替dna溶液,其它操作與上面相同.此組正常情況下在含抗生素的lb平板上應沒有菌落出現.
對照組2:以同體積的無菌雙蒸水代替dna溶液,但塗板時只取5μl 菌液塗布於不含抗生素的lb平板上,此組正常情況下應產生大量菌落.
四、 計算轉化率 統計每個培養皿中的菌落數. 轉化後在含抗生素的平板上長出的菌落即為轉化子,根據此皿中的菌落數可計算出轉化子總數和轉化頻率,公式如下： 轉化子總數＝菌落數×稀釋倍數×轉化反應原液總體積／塗板菌液體積 轉化頻率**化子數／每mg質粒dna）＝轉化子總數／質粒dna加入量(mg) 感受態細胞總數＝對照組2菌落數×稀釋倍數×菌液總體積／塗板菌液體積 感受態細胞轉化效率＝轉化子總數／感受態細胞總數 [注意] 本實驗方法也適用於其它e.
coli受體菌株的不同的質粒dna的轉化.但它們的轉化效率並不一定一樣.有的轉化效率高,需將轉化液進行多梯度稀釋塗板才能得到單菌落平板,而有的轉化效率低,塗板時必須將菌液濃縮(如離心),才能較準確的計算轉化率.
3樓：a股纏論
為什麼用cacl2溶液懸浮細胞時必須輕輕懸浮 由於聚氨酯原料和配方的多樣性，水性聚氨酯開發40年左右的時間，人們已研究出許多種製備方法和製備配方。水性聚氨酯品種繁多，可以按多種方法分類。
感受態細胞是如何製備的
4樓：為水情狂
1、將培養液轉入離心管中,冰上放置10分鐘,然後於4℃下3000g離心10分鐘。
2、 棄去上清,用預冷的0.05mol/l的cacl2 溶液10ml輕輕懸浮細胞,冰上放置15-30分鐘後,4℃下3000g離心10分鐘。
3、棄去上清,加入4ml預冷含15%甘油的0.05mol/l的cacl2 溶液,輕輕懸浮細胞,冰上放置幾分鐘,即成感受態細胞懸液。
4、 感受態細胞分裝成200μl的小份,貯存於-70℃可儲存半年。
轉化實驗中，熱激完成後，感受態細胞為什麼要繼續冰上放置5 分鐘
5樓：匿名使用者
化轉時,感受態細胞膜由於吸附陽離子（ca2+等）呈液晶狀態,受到熱激後,細胞膜出現裂隙,外源dna進入細胞,此時細胞非常脆弱,將其冰浴冷卻,細胞膜修復閉合,進行下一步的復甦時細胞存活率將提高.
如何製備大腸桿菌感受態細胞
6樓：匿名使用者
（1）挑取大腸桿菌單菌落，接種於5 ml無抗生素的lb液體培養基中，37℃下振盪培養13h，至對數生長後期。將該菌懸液以1:50 的比例接種於100 ml lb 液體培養基中，37℃振盪培養2-3h至od600＝0.
5。（2）在無菌條件下將培養液轉入離心管中，冰上放置10 min，使培養物冷卻至0℃，然後4℃，4000rpm離心10min；
（3）棄去上清，倒置1 min，以便將培養液流盡；
（4）用冰預冷的0.1 mol/l的cacl2溶液10 ml輕輕懸浮細胞，充分混勻，冰上放置30 min後，4℃下4000rpm離心10min；
（5）棄去上清，並倒置1 min，以便最後的痕量培養液流盡；
（6）加入4 ml預冷含15%甘油的0.1 mol/l的cacl2溶液，輕輕懸浮細胞，冰上放置幾分鐘，即成感受態細胞懸液；
（7）感受態細胞100 μl分裝，貯存於-70 ℃儲存備用。
製備感受態細胞時為什麼氯化鈣要冷凍
7樓：匿名使用者
不知道您到底bai想知道什麼？du
製備感受態細胞zhi當然要冷凍啦，冷dao熱交替使版得細胞壁很脆弱，這樣外源dna匯入權才更加容易。
在製備轉基因時，匯入外源dna方法有很多的，不過目前比較簡單和普遍的做法就是用氯化鈣處理的。謝謝！
感受態細胞的製備為什麼要在冰上操作
8樓：阿魯巴星人
停止細菌增殖
加入金屬離子後，細胞膜低溫容易形成液晶態，轉化效率高。
CaCl2製備感受態細胞轉化DNA時,低溫的目的是什麼 熱休
冰浴過程中，原來加在溶液中的鈣離子和細菌細胞膜結合，在低溫下形成液晶結構，這樣，在42度熱激下，這種液晶結構收縮，將細胞膜扯開孔道，使dna進入細菌細胞中。這就是原理。在0 4 cacl2低滲溶液中，細胞膨脹成球狀，轉化混合物中的dna形成抗dna酶的羥基 鈣磷酸複合物黏附於細胞表面，較低的溫度也降...
為什麼用鈣離子處理原核細胞獲感受態細胞
感受態細胞 petent cell 理化方法誘導細胞,使其處於最適攝取和容納外來dna的生理專狀態。主要原理屬就是通過處理使細胞的通透性變大,直觀的說,使得細胞膜表面出現一些孔洞,便於外源基因或載體進入感受態細胞。由於細胞膜的流動性,這種孔洞會被細胞自身所修復。用鈣離子處理成為感受態細胞的轉化 只是...
感受態細胞為什麼要放倒80度儲存
您好，感受態細胞收到過點選或者氯化鈣氯化銫等的處理，細胞壁以及細胞膜都有損傷，可以說是十分脆弱的細胞，如果放於 20 儲存，時間長了細胞內部液化度較高的情況下，細胞會由於流動性的原因造成不可逆損傷，甚至死亡。所以要放於 80攝氏度。首先你要明白，凍存的細胞，溫度越低，儲存的時間越長，像哺乳類細胞凍 ...