1樓：就喜歡理財
方法一： 細菌轉化的方法多以mendel和higa（1970）的發現為基礎，其基本方法是用冰預冷的cacl2或多種2價陽離子等處理細菌，使之進入感受態得以轉化。 用cacl2製備新鮮或冷凍的大腸桿菌感受態細胞，常用於成批製備感受態細菌。
感受態細胞的製備和轉化中 為什麼要加兩次cacl2? cacl2為什麼要預冷？
2樓：匿名使用者
感受態的製備，需要儘量排除雜質的汙染，多次離心加cacl2，只是為了使培養基儘量棄去。
感受態的整個製備過程都要求在冰上操作，cacl2需要預冷是顯然的操作，以最大限度保證細胞活性和轉化效率。
大腸桿菌感受態細胞製備為什麼要用cacl2處理細菌
3樓：阿魯巴星人
ca離子沉聚在細胞膜表面會使得細胞膜呈一種液晶的狀態，這種狀態便於在熱激條件下形成縫隙，便於轉化質粒。
感受態細胞製備步驟6和8中都加入了cacl2目的一樣嗎？它們的作用分別是什麼
4樓：親咔丨
： 細菌轉化mendelhiga（1970）發現基礎其基本用冰預冷cacl2或種2價陽離等處理細菌使進入受態轉化 用cacl2製備新鮮或冷凍腸桿菌受態細胞用於批製備受態細
為什麼用cacl2溶液懸浮細胞時必須輕輕懸浮
5樓：匿名使用者
大腸桿菌感受態細胞的製備和轉化準備： 一.材料 e.
coli dh5α菌株:rˉ,mˉ,ampˉ；pbs質粒dna:購買或實驗室自制,eppendorf管.
二.裝置 恆溫搖床,電熱恆溫培養箱,臺式高速離心機,無菌工作臺,低溫冰箱,恆溫水浴鍋,製冰機,分光光度計,微量移液槍. 三.
試劑 1.lb固體和液體培養基 2.amp母液 3.
含amp的lb固體培養基:將配好的lb固體培養基高壓滅菌後冷卻至60℃左右,加入amp儲存液,使終濃度為50ug/ml,搖勻後鋪板. 4.
麥康凱培養基(maconkey agar):取52g麥康凱瓊脂,加蒸餾水1000ml,微火煮沸至完全溶解,高壓滅菌,待冷至60℃左右加入amp儲存液使終濃度為50ug/ml,然後搖勻後塗板. 5.
0.05mol/l cacl2溶液:稱取0.
28g cacl2(無水,分析純),溶於50ml重蒸水中,定容至100ml,高壓滅菌. 6.含15%甘油的0.
05mol/l cacl2:稱取0.28g cacl2(無水,分析純),溶於50ml重蒸水中,加入15ml甘油,定容至100ml,高壓滅菌.
操作步驟： 一、 受體菌的培養 從lb平板上挑取新活化的e.coli dh5α單菌落,接種於3-5ml lb液體培養基中,37℃下振盪培養12小時左右,直至對數生長後期.
將該菌懸液以1:100-1:50的比例接種於100ml lb液體培養基中,37℃振盪培養2-3小時至od600 ＝0.
5左右.
二、 感受態細胞的製備 ( cacl2 法) 1、將培養液轉入離心管中,冰上放置10分鐘,然後於4℃下3000g離心10分鐘. 2、 棄去上清,用預冷的0.05mol/l的cacl2 溶液10ml輕輕懸浮細胞,冰上放置15-30分鐘後,4℃下3000g離心10分鐘.
3、棄去上清,加入4ml預冷含15%甘油的0.05mol/l的cacl2 溶液,輕輕懸浮細胞,冰上放置幾分鐘,即成感受態細胞懸液. 4、 感受態細胞分裝成200μl的小份,貯存於-70℃可儲存半年.
三、 轉化 1、從-70℃冰箱中取200μl感受態細胞懸液,室溫下使其解凍,解凍後立即置冰上. 2、 加入pbs質粒dna溶液(含量不超過50ng,體積不超過10μl),輕輕搖勻,冰上放置30分鐘後. 3、42℃水浴中熱擊90秒或37℃水浴5分鐘,熱擊後迅速置於冰上冷卻3-5分鐘.
4、向管中加入1ml lb液體培養基(不含amp),混勻後37℃振盪培養1小時,使細菌恢復正常生長狀態,並表達質粒編碼的抗生素抗性基因(ampr ). 5、將上述菌液搖勻後取100μl 塗布於含amp的篩選平板上,正面向上放置半小時,待菌液完全被培養基吸收後倒置培養皿,37℃培養16-24小時. 同時做兩個對照:
對照組1:以同體積的無菌雙蒸水代替dna溶液,其它操作與上面相同.此組正常情況下在含抗生素的lb平板上應沒有菌落出現.
對照組2:以同體積的無菌雙蒸水代替dna溶液,但塗板時只取5μl 菌液塗布於不含抗生素的lb平板上,此組正常情況下應產生大量菌落.
四、 計算轉化率 統計每個培養皿中的菌落數. 轉化後在含抗生素的平板上長出的菌落即為轉化子,根據此皿中的菌落數可計算出轉化子總數和轉化頻率,公式如下： 轉化子總數＝菌落數×稀釋倍數×轉化反應原液總體積／塗板菌液體積 轉化頻率**化子數／每mg質粒dna）＝轉化子總數／質粒dna加入量(mg) 感受態細胞總數＝對照組2菌落數×稀釋倍數×菌液總體積／塗板菌液體積 感受態細胞轉化效率＝轉化子總數／感受態細胞總數 [注意] 本實驗方法也適用於其它e.
coli受體菌株的不同的質粒dna的轉化.但它們的轉化效率並不一定一樣.有的轉化效率高,需將轉化液進行多梯度稀釋塗板才能得到單菌落平板,而有的轉化效率低,塗板時必須將菌液濃縮(如離心),才能較準確的計算轉化率.
6樓：a股纏論
為什麼用cacl2溶液懸浮細胞時必須輕輕懸浮 由於聚氨酯原料和配方的多樣性，水性聚氨酯開發40年左右的時間，人們已研究出許多種製備方法和製備配方。水性聚氨酯品種繁多，可以按多種方法分類。
cacl2製備感受態細胞轉化dna時,低溫的目的是什麼?熱休克的溫度及目的是什麼 5
7樓：
冰浴過程中，原來加在溶液中的鈣離子和細菌細胞膜結合，在低溫下形成液晶結構，這樣，在42度熱激下，這種液晶結構收縮，將細胞膜扯開孔道，使dna進入細菌細胞中。這就是原理。
8樓：匿名使用者
在0～4℃，cacl2低滲溶液中，細胞膨脹成球狀，轉化混合物中的dna形成抗dna酶的羥基－鈣磷酸複合物黏附於細胞表面，較低的溫度也降低了相關酶的活性較好的儲存了dna的，
這裡的冷處理和熱激使細胞變成可接受dna狀態的作用機理目前是還不為人所知的，自從mendel和higa在2023年發現這一處理效果以來，所有的轉化都在這麼做，效果還是值得肯定的。
用cacl2製備感受態細胞怎麼總是失敗
9樓：匿名使用者
如果你覺得感受態沒有問題，那麼就先排除質粒和平板的問題。
轉化效率的評估
我們建議轉化（如下所述）不同濃度中等大小的質粒（約5kb）來評估轉化效率，第一次檢驗，轉化10-9,10-10,10-11g質粒dna比較有意義。製備的最好的能達到108或更多克隆每ug質粒dna，而達到5×106每ug質粒dna可能已經適合做大多數的克隆了。另外，建議把自制的感受態塗到ap+kn板以排除汙染有抗性的雜菌。
10．每個轉化用200ul感受態，並將菌體冰浴。
11.加入連線物（5-10ul連線物/200ul菌液），小心彈勻後冰浴30min.
12.42℃熱擊30s（不用攪動）。
13.置於冰浴2min.
14.加800ul lb並在37℃振盪培養1h以使細胞恢復。
15.1000g離心，然後用200ul lb重懸並塗板，37℃培養過夜。
16.數菌落。如果你沒有專門的數菌落的儀器，那麼可在平板下墊一層黑色背景以便於觀察菌落。
用黑色鋼筆在平板的底部標記數過的克隆。轉化效率取決於10-6g質粒產生的克隆數量的多少。
10樓：nin微
用試劑盒吧。我們對比過cacl2和試劑盒，cacl2是很杯具的。。。
11樓：呂春偉
懷疑call2的純度，有條件可換用優級純試劑
大腸桿菌感受態細胞製備時的cacl2濃度到底是多少
12樓：匿名使用者
（1）質粒dna的質量和濃度： 用於轉化的質粒dna應主要是超螺旋態的，轉化率與外源dna的濃度在一定範圍內成正比，但當加入的外源dna的量過多或體積過大時，則會使轉化率下降。一般地，dna溶液的體積不應超過感受態細胞體積的5%，1ng的cccdna即可使50ul的感受態細胞達到飽和。
對於以質粒為載體的重組分子而言，分子量大的轉化效率低，實驗證明，大於30kb的重組質粒將很難進行轉化。此外，重組dna分子的構型與轉化效率也密切相關，環狀重組質粒的轉化率較分子量相同的線性重組質粒高10~100倍，因此重組dna大都構成環狀雙螺旋分子。 （2）感受態細胞的質量：
所用的cacl2等試劑均需是最高純度的，並用最純淨的水配製，最好分裝儲存於4℃ （3）細胞的生長狀態和密度 最好從-70℃或-20℃甘油儲存的菌種中直接轉接用於製備感受態細胞的菌液。不要用已經過多次轉接，及貯存在4℃的培養菌液。細胞生長密度以每毫升培養液中的細胞數在5×107個左右為佳。
即應用對數期或對數生長前期的細菌，可通過測定培養液的od600控制。對tg1菌株，od600為0．5時，細胞密度在5×107個/ml左右。（應注意od600值與細胞數之間的關係隨菌株的不同而不同）。
密度過高或不足均會使轉化率下降。 （二）感受態細胞轉化中的影響： 整個操作過程均應在無菌條件下進行，所用器皿，如離心管，移液槍頭等最好是新的，並經高壓滅菌處理。
所有的試劑都要滅菌，且注意防止被其它試劑、dna酶或雜dna所汙染，否則均會影響轉化效率或雜dna的轉入。整個操作均需在冰上進行，不能離開冰浴，否則細胞轉化率將會降低。
cacl2法制感受態細胞：最近用此法制備感受態細胞，但是轉化後的效率很低，幾天看看平白機會一個沒有長。
13樓：匿名使用者
首先要掌握好培養時間，細胞對數生長期的時候再做，一般od600為0.5左右。其次，在製備的時候要注意一定要整個過程都在冰上，保持低溫很重要，特別是離心過程，冷凍離心機要先預冷後再用。
實在不行試試冰浴水洗法吧，操作簡單而且電擊轉化效率很高的。
CaCl2製備感受態細胞轉化DNA時,低溫的目的是什麼 熱休
冰浴過程中，原來加在溶液中的鈣離子和細菌細胞膜結合，在低溫下形成液晶結構，這樣，在42度熱激下，這種液晶結構收縮，將細胞膜扯開孔道，使dna進入細菌細胞中。這就是原理。在0 4 cacl2低滲溶液中，細胞膨脹成球狀，轉化混合物中的dna形成抗dna酶的羥基 鈣磷酸複合物黏附於細胞表面，較低的溫度也降...
感受態細胞的製備為什麼要在冰上操作
停止細菌增殖 加入金屬離子後，細胞膜低溫容易形成液晶態，轉化效率高。感受態細胞的製備時有什麼注意事項 1 培養溫度。較低的溫度培養有利於感受態的形成，這樣可以獲得較高的感受態，但太低又不實用，因而產生了 inoue 的高效感受態製備方法，它實際是利用了所有有利於感受態的文獻而得出的一 個非常理想方法...
用鈣離子處理成為感受態細胞的轉化方法
原因 目的基因匯入植物細胞時，由於沒有經過鈣離子處理沒有變成感受態細胞，細胞的通透性小，目的基因難以進入細胞。感受態細胞主要原理 1 通過處理使細胞的通透性變大。2 使得細胞膜表面出現一些孔洞，便於外源基因或載體進入感受態細胞。3 由於細胞膜的流動性，這種孔洞會被細胞自身所修復。擴充套件資料 氯化鈣...