1樓：匿名使用者
重組質粒構建是常用的分子生物學手段，其實只是最基本的方法，一般一個星期同時構建三二個組質粒是沒有問題的。在國內先進的實驗中，也大都是由實驗員搞定。但是其中還是有些基本的技巧需要掌握。
在這裡將我的心得分享於大家，這也是我本人幾年來一線工作時的經驗積累，以期能為谷友提供借鑑，讓大家在實驗中少走彎路。所涉及內容如下：
1) 克隆基因的酶切位點問題
2) 載體酶切的問題
3) 連線片段濃度比的問題
在闡明上述問題同時，本人儘可能舉些實驗中的問題案例予以說明。
一、克隆基因的酶切位點問題
1、克隆位點選擇的問題。首先要對目標基因進行酶切位點掃描分析，列出其所含酶切位點清單。然後對照質粒多克隆位點，所選擇的克隆位點必須是目標基因所不含的酶切位點。這是常識，不贅述。
2、保護鹼基數目的問題。在設計pcr引物時，引入酶切位點後，常常要加入保護鹼基，這是大家所熟知的。但是保護鹼基數量多少，可能被新手所忽視。
這種忽視碰可能會大大影響後續的實驗進展。
一般情況下，普通的內切酶只加入兩個保護鹼基，其內切反應就可以正常進行；而有一類，僅僅只加入兩個保護鹼基，其內切反應就不能正常進行，這是因為內切酶不能正常結合dn段上。如ndei就屬這類，需要加入至少6個保護鹼基，常用的hindiii也要三個。
2樓：匿名使用者
選擇合適的內切酶，作用時間和溫度要適宜，連線過程中不要汙染，注意片段和質粒的比例
構建重組質粒之前為什麼先連線t載體
3樓：匿名使用者
先連線t載體是為了提高轉化效率一般來說市面上**的t載體都進行了優化，容易連線片段（也就是效率較高），因此構建表達載體時有時會先連線t載體。同時t載體的測序引物比較明確（商業化的緣故），因此測序也方便一些。更重要的是，t載體往往設計了藍白斑篩選的功能，插入片段的載體會呈現白色，這樣也容易區分驗證，不用每個單菌落都拿去做colonypcr或提質粒酶切驗證。
當然也不是絕對的，我們實驗室就經常直接把片段酶切後連線表達載體，不經過t載體這一步，其實影響並不大。如果你的情況比較特殊（比如片段較大，或是對應的表達載體拷貝數較低等），可以考慮連線t載體，不然的話不是非常必要。
重組質粒構建 一個dna為什麼要接入兩個不同的載體？
4樓：匿名使用者
哈哈，我就是做這個的
，因為基因直接克隆出來，酶切得不太好，而且也不容易連到pet上面，而pmd是克隆載體，上面新增了多聚t，pcr的產物末端通常會多p出幾個多聚a，a和t互補，再用連線液連線，就非常容易連上，pmd是高拷貝質粒，將會複製出很多質粒，再酶切提出裡面的目的片段，連到pet上就相對容易了
5樓：來祿張廖湘雲
我。。知。。道
加。。我。。私。。聊
把目的基因連線到質粒上構建重組質粒時該如何選擇限制性內切酶？引物如何設計？
6樓：法師藥材店
重組時選復擇你的目的制基因上沒有，而質粒的多克隆位點上有的酶切位點，一般重組質粒需要兩個酶，所以你要選擇兩個酶切位點，注意儘量避免使用切出平末端的酶。重組引物設計時首先你要確定你選擇的兩個酶在的酶切位點在質粒的多克隆位點上的排列順序，這個不能錯，不然序列就會接反。一般設計重組引物的時候，在上游引物5』端前面加上載體多克隆位點排列在前面的酶切位點序列，在下游引物5『端前面則加上後面的一個酶切位點，酶切位點加好後，注意5』端還需要加上保護鹼基，這個具體你可以去查下內切酶的說明書。
然後你要注意，根據你的載體需要，是否要在引物上帶上啟動子和終止子。
質粒的標記基因有哪些種類,質粒和重組質粒中標記基因的作用分別是什麼？
按其用途可將標記基因分為選擇標記基因和篩選標記基因，選擇標記用於鑑別目標dna 載體 的存在，將成功轉化了載體的宿主挑選出來，篩選標記可用於將特殊表型的重組子挑選出來。質粒和重組質粒中標記基因的作用分別是什麼？1 質粒中標記基因的作用是有利於對目的基因是否匯入進行檢測。2 重組質粒上的標記基因的作用...
我的重組質粒想轉到納豆枯草芽孢桿菌裡,但是一直轉不進去,請大家幫忙
一樓的完全是在瞎說。用電擊的方法就可以了，或者用 糖化多聚賴氨酸導向配體具有良好的匯入重組質粒進入肝細胞的功能,且更適合於應用.轉枯草建議還是電轉，化學法不是說一定不行，效率太低，而且受限太多。這是我們lab的protocol，你試試。1 接種b subtilis於3mllb培養基中，過夜培養.2 ...
用質粒中的抗生素抗性基因可以篩選出含重組DNA的植物細胞哪
應該是用抗生素可以篩選出含有抗生素抗性的植物細胞。望採納 為什麼質粒中含有抗生素a抗性基因就用抗生素a篩選？植物自身沒有抵抗抗生素的基因。質粒中的基因重組到一些植物細胞中。一些沒有重組到細胞中。沒有重組到抗性基因的細胞不具有抗性。所以用抗生素施加到所有細胞上的時候。重組的細胞可以繼續正常存在。沒有重...