1樓：擎科生物
引物設計是決定pcr反應成敗的最重要因素。引物設計有兩個主要考慮因素：特異性和擴增效率。
特異性是由錯配的頻率決定的，特異性差的引物易產生錯誤的擴增產物。擴增效率是指引物以每迴圈增加兩倍擴增產物達到理論最優的能力。
遵循原則如下：
1. 引物長度：引物的最佳長度為24或25個鹼基左右。
但是如果需要調整tm值，引物的長度可以控制在21至28個鹼基之間。當擴增≥10 kb長片段時，25-35個鹼基之間的引物可以提供更好的結果。引物過短，會降低產物的特異性，每增加一個核苷酸，引物特異性可以提高 4 倍。
引物過長，會使退火過程不完全，與模板結合不充分，以至引起擴增產物的明顯減少。
2. 引物末端： 引物3』端最後一個鹼基最好為g或者c；引物 3』端應避免出現髮夾結構。
3. 引物g+c：含量 引物的gc含量控制在40%-60%之間。
4. tm值：引物額外附加序列，即與模板非互配對序列，不應參與引物 tm 的值計算；正向引物和反向引物的tm值相差不超過5℃為佳，tm值調整至55℃ -65℃為佳。
5. 鹼基的分佈：引物 a、g、c、t整體分佈要儘量均勻，避免使用gc或者at含量高的區域；避免連續出現4個及以上的相同鹼基，或者某兩個核苷酸連續重複出現（例如，acccc或atatatat；引物內部或者兩條引物之間避免有5個鹼基以上的互補序列；兩條引物的 3』端避免有3個鹼基以上的互補序列。
6. 序列特異性：引物設計完畢請使用 ncbi blast功能檢索引物特異性，以避免非特異性擴增產生。
注意： pcr的產量通常取決於pcr引物的3』端，引物間形成二聚體會降低擴增效率。
2樓：機器
① 特異性：引物應在保守區內設計並具有特異性，引物與非特異擴增序列的同源性不要超過70%或有連續8個互補鹼基同源。
引物長度：一般在15~30鹼基之間，引物有效長度ln=2(g+c)+a+t，ln值不能大於38。（ln>38時，最適延伸溫度會超過taq dna聚合酶的最適溫度74℃，不能保證產物的特異性）
目的片段二級結構：要擴增的片段單鏈不能形成二級結構，擴增片段長度為100~600鹼基對。
引物二級結構：引物自身連續互補鹼基不能多於3bp，一對引物間連續鹼基的同源性或互補性不能多於4bp。
引物的5′端：可以被修飾而不影響擴增的特異性。5′端修飾包括：
加酶切位點；標記生物素、熒光、地高辛、eu3+等；引入蛋白質結合dna序列；引入突變位點；插入與缺失突變序列和引入啟動子序列等。
引物的3′端：絕對不能進行任何修飾，3′端也不能有形成任何二級結構的可能，引物3′端不要終止於密碼子的第3位。
tm值：按公式tm=4(g+c)+2(a+t) 估計引物的tm值，則有效引物的tm為50~70℃。儘可能保證上下游引物的tm值一致，一般不超過 2℃。
若引物中的 g+c 含量相對偏低，則可以使引物長度稍長，而保證一定的退火溫度。退火溫度約為tm-4。
gc含量：g+c含量在40%~60%之間。四種鹼基的分佈最好隨機，不要有聚嘌呤或聚嘧啶存在。尤其3′端不應超過3個連續的g或c，因這樣會使引物在g+c富集序列區引發錯誤。
pcr引物設計的原理？
3樓：月似當時
pcr中引物的作用是作為dna複製開始時dna聚合酶的結合位點，在細胞外的條件下，只有通過引物，dna才可以開始進行復制。
人工合成的兩段寡核苷酸序列，一個引物與感興趣區域一端的一條dna模板鏈互補，另一個引物與感興趣區域另一端的另一條dna模板鏈互補。
pcr反應中有兩條引物，即5′端引物和3′引物。設計引物時以一條dna單鏈為基準（常以資訊鏈為基準），5′端引物與位於待擴增片段5′端上的一小段dna序列相同；3′端引物與位於待擴增片段3′端的一小段dna序列互補。
pcr引物設計原則
4樓：小蠻
引物長度與延伸溫度基本呈正比，還影響pcr的特異性。
延伸溫度一般在酶活性溫度附近，從而去調整引物長度。
引物長度的上限並不很重要，主要與反應效率有關。由於熵的原因，引物越短，它退火結合到靶dna上形成供dna聚合酶結合的穩定雙鏈模板的速率越大。一般，如果擴增有一定程度不均一性的序列，則需要28~35個鹼基長的寡核苷酸鏈作引物。
5樓：匿名使用者
對不起，無此網路資源。。。
pcr引物設計應遵循哪些原則
6樓：匿名使用者
長度18-25bp，沒有錯配，3』端不是a，gc含量在40到60%
7樓：匿名使用者
1、引物長度一般為15-30bp，常用的為18-27bp，但不能大於38bp；
2、引物gc含量一般為40%-60%，以45-55%為宜，上下游引物gc含量和tm值要保持接近；
3、引物所對應的模板序列的tm值最好在72℃左右，至少要在55-80℃之間，tm值曲線以選取72度附近為佳，5'到 3』的下降形狀也有利於引物與模板的結合；
4、δg值（自由能）反應了引物與模板結合的強弱程度，3'端的δg值相對要低，且絕對值不要超過9，否則不利於正確引發反應，3'末端雙鏈的δg值在0--2kcal/mol時，pcr產量幾乎達到百分之百，但在-6時只達到40%，-8時少於20%，-10時接近於0；
5、錯配率一般不要超過100，否則會出現非目的條帶。但對於某些特定的模板序列，還應結合比較其在正確位點的引發效率。如果兩者相差很大，比如在正確位點的引發效率為340以上，而在錯誤位點的引發效率為110，並且不好找到其他更合適的引物，那麼這對引物是可以接受的；
6、frq曲線為oligo6軟體新引進的一個指標，解釋了序列片段存在的重複幾率大小，選取引物時，應該用frq值相對較低的片段；
7、引物二聚體及髮卡結構的能量的絕對值一般不要超過，否則容易產生引物二聚體而且會降低引物濃度從而導致pcr不能正常發生；
端最好不要是連續鹼基，ggg或ccc會導致錯誤的引發，同時3'端最後一個鹼基最好不要是a或t，若是，會導致錯配；
9、以公式tm=4*（g+c）+2*（a+t）-5計算tm值，也就是退火溫度。選擇較低tm值的引物的退火溫度為反應的退火溫度，最好保證每個引物的tm值相匹配，且在70-75℃範圍內；
10、模板與穩定性較小的引物之間的tm的差異越小，pcr的效率越高。因為解鏈溫度也取決於它的長度，如果期待的產物長度等於或小於500bp，選用端的引物（16-18bp），如果產物長5kb，則用24bp的引物；
11、在dna測序和pcr中最好用5'末端穩定（gc含量多），而3'端不穩定（at含量多）的引物，這種引物的結構可以有效地消除假引發反應；
12、引物和產物之間的tm值相差別太大，20攝氏度範圍內最好。
13、對引物的修飾一般在5'端進行，例如加酶切位點，加酶切位點的同時要根據需要新增保護鹼基。
怎樣設計pcr引物
8樓：匿名使用者
引物設計需要注意的地方很多，在大多數情況下，我們都是在知道已知模板序列時進行pcr擴增的。
設計的目的是在兩個目標間取得平衡：擴增特異性和擴增效率。引物分析軟體將試圖通過使用每一引物設計變化的預定值在這兩個目標間取得平衡。設計引用有一些需要注意的基本原理：
引物長度。一般引物長度為18~30鹼基。總的說來，決定引物退火溫度（tm值）最重要的因素就是引物的長度。有以下公式可以用於粗略計算引物的退火溫度。
在引物長度小於20bp時：[4(g+c)+2(a+t)]-5℃
在引物長度大於20bp時：
另外有許多軟體也可以對退火溫度進行計算，其計算原理會各有不同，因此有時計算出的數值可能會有少量差距。為了優化pcr反應，使用確保退火溫度不低於54℃的最短的引物可獲得最好的效率和特異性。
引物長度的上限並不很重要，主要與反應效率有關。由於熵的原因，引物越長，它退火結合到靶dna上形成供dna聚合酶結合的穩定雙鏈模板的速率越小。
gc含量。一般引物序列中g+c含量一般為40%~60%，一對引物的gc含量和tm值應該協調。若是引物存在嚴重的gc傾向或at傾向則可以在引物5』端加適量的a、t或g、c尾巴。
退火溫度。退火溫度需要比解鏈溫度低5℃，如果引物鹼基數較少，可以適當提高退火溫度，這樣可以使pcr的特異性增加；如果鹼基數較多，那麼可以適當減低退火溫度，是dna雙鏈結合。一對引物的退火溫度相差4℃～6℃不會影響pcr的產率，但是理想情況下一對引物的退火。
溫度是一樣的，可以在55℃～75℃間變化。
避免擴增模板的二級結構區域。
選擇擴增片段時最好避開模板的二級結構區域。用有關計算機軟體可以**估計目的片段的穩定二級結構，有助於選擇模板。實驗表明，待擴區域自由能（△g）小於時，擴增往往不能成功。
若不能避開這一區域時，用7-deaza-2』-脫氧gtp取代dgtp對擴增。
的成功是有幫助的。
與靶dna的錯配。
當被擴增的靶dna序列較大的時候，一個引物就有可能與靶dna的多個地方結合，造成結果中有多個條帶出現。這個時候有必要先使用blast軟體進行檢測，**：
9樓：匿名使用者
pcr引物是在進行pcr擴增的原料，它的組成是需擴增的dna鏈的一部分鹼基的互補配對。所以，設計pcr引物就是要擴增的dna的起始的一部分鹼基的片段。
10樓：匿名使用者
用引物設計軟體primer 來設計。
設計pcr引物的主要原則是什麼？
11樓：泉淑琴永月
pcr的技術的主要步驟及pcr引物設計的一般原則分述如下：
1、pcr的技術的主要步驟：
dna變性：（90℃-96℃）：雙鏈dna模板在熱作用下，氫鍵斷裂，形成單鏈dna
退火：（60℃-65℃）：系統溫度降低，引物與dna模板結合，形成區域性雙鏈。
延伸：（70℃-75℃）：在taq酶（在72℃左右，活性最佳）的作用下，以dntp為原料，從引物的3′端開始以從5′→3′端的方向延伸，合成與模板互補的dna鏈。
每一迴圈經過變性、退火和延伸，dna含量即增加一倍。如圖所示：現在有些pcr因為擴增區很短，即使taq酶活性不是最佳也能在很短的時間內複製完成，因此可以改為兩步法，即退火和延伸同時在60℃-65℃間進行，以減少一次升降溫過程，提高了反應速度。
2、引物設計的基本原則。
引物長度：15-30bp，常用為20bp左右。
引物鹼基：g+c含量以40-60%為宜，g+c太少擴增效果不佳，g+c
過多易出現非特異條帶。atgc最好隨機分佈，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列參照。
引物內部不應出現互補序列。
兩個引物之間不應存在互補序列，尤其是避免3
端的互補重疊。
引物與非特異擴增區的序列的同源性不要超過70%，引物3′末端連續8個鹼基在待擴增區以外不能有完全互補序列，否則易導致非特異性擴增。
引物3『端的鹼基，特別是最末及倒數第二個鹼基，應嚴格要求配對，最佳選擇是g和c。
引物的5端可以修飾。如附加限制酶位點，引入突變位點，用生物素、熒光物質、地高辛標記，加入其它短序列，包括起始密碼子、終止密碼子等。
農業景觀在設計中應遵循哪些原則,PCR引物設計應遵循哪些原則
一 生態的原則 二 高效益原則 三 參與性原則 四 突出特色的原則 五 文化渲染的原則 pcr引物設計應遵循哪些原則 pcr引物設計的11條 法則 1.引物最好在模板cdna的保守區內設計。dna序列的保守區是通過物種間相似序列的比較確定的。在ncbi上搜尋不同物種的同一基因，通過序列分析軟體 比如...
引物是怎麼合成的,PCR引物是什麼
自己把引物序列設計好,郵件 填表把它傳送到上海生工公司,他們會引物合成好,裝在ep管裡寄給你啊。首先是測定引物的od值,然而將引物溶解,最後合成引物。目前,引物合成最重用的方法是固相亞磷醯胺三酯法,引物它具有高效 快速的偶聯以及起始反應物比較穩定的特點。引物合成是通過測定引物的od值,溶解引物,最終...
利用PCR技術擴增目的基因，引物是什麼
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