1樓：
1.引物的設計是否合適：一對引物的tm值最好比較接近，引物錯配，形成莖環儘可能少；
2.模板的濃度要合適，具體的濃度數值在分子克隆上有（我記不清了），基因組，質粒或是rt產物；
3.最好有個正對照組和負對照組，監測你的pcr體系是否正常。正對照組能確定你的pcr體系是否能有效地運轉，負對照組能鑑定你的pcr體系中是否有汙染等；
4.pcr反應體系，這個你得根據你所使用的dan聚合酶，來確定適宜的mg2+濃度，dntp的濃度
5.pcr反應引數，也得根據你的pcr目的來確定。一般來說，94-95度，變性10-30秒；（tm-5）度退火10-30秒，72度（一般taq酶）、68度（kod-plus）或其他溫度（根據你所使用的酶來）延伸，延伸時間（根據你目的片段大小及酶的擴增速率來定，一般500bp片段，普通taq酶的話，30秒足夠了），迴圈數得根據你的目的片段在模板中的丰度來定，不清楚的話，就先來30-35個迴圈嘍！
2樓：匿名使用者
引物的合成，反應溫度，離子強度等
pcr實驗操作注意事項有哪些
3樓：合夥人金林
1、必須在無菌無塵環境下進行操作；
2、檢測人員必須通過國家臨檢中心業務培訓並取得合格證書；
3、必須擁有標準的的pcr熒光實驗室；
4、後pcr區pcr完成以後，應該留出一個專門用於反應後處理樣品的地方。
擴充套件資料
pcr實驗特點：
1、靈敏度高：pcr實驗產物的生成量是以指數方式增加的，能從100萬個細胞中檢出一個靶細胞；在病毒的檢測中，pcr的靈敏度可達3個rfu；在細菌學中最小檢出率為3個細菌。
2、簡便、快速：pcr實驗反應一般在2～4 小時完成擴增反應。擴增產物一般用電泳分析，不一定要用同位素，無放射性汙染、易推廣。
3、純度要求低：不需要分離病毒或細菌及培養細胞，dna 粗製品及rna均可作為擴增模板。可直接用臨床標本如血液、體腔液、洗嗽液、毛髮、細胞、活組織等dna擴增檢測。
4樓：愛生活的淇哥
1、必須擁有標準的的pcr熒光實驗室。
2、檢測裝置必須符合標準pcr熒光實驗室設定要求
熒光定量pcr儀+實時熒光定量試劑+通用電腦+自動分析軟體，構成pcr-dna/rna實時熒光定量檢測系統。
3、必須通過國家臨床檢驗中心的驗收和認證。
4、檢測人員必須通過國家臨檢中心業務培訓並取得合格證書;pcr實驗室內工作人員必須參加由國家衛生部或各省臨床檢驗中心舉辦的臨床基因擴增培訓班，並持證上崗。pcr實驗室通過驗收，實驗室至少必須應有兩個以上持有「臨床基因檢測上崗證」。
5、必須在無菌無塵環境下進行操作pcr實驗室必須建立嚴格的實驗室管理制度、建立標準化操作程式（sop）、建立系列質量管理檔案等，確保實驗室日常執行符合國家衛生部的要求，確保檢測結果準確、確保實驗室衛生安全，確保實驗室長期穩定執行。
擴充套件資料
pcr實驗的應用價值：
能夠對患者病情進行科學、準確、實時的掌控，並結合抗hbv與t細胞免疫來打破免疫耐受，阻斷肝病病毒複製的**、有效的分解肝炎病毒，解決了乙肝病毒易變異、耐藥，病毒複製模板難以**。
人體免疫耐受狀態不易打破等醫學難題，能迅速消除臨床症狀，而且有效抑制乙肝病毒複製，明顯加快e抗原、抗體的血清轉換速度，殺滅血液及肝細胞內的病毒，為防止再感染提供了長期保護，有效阻斷和逆轉肝纖維化、肝硬化程序。
5樓：北京索萊寶科技****
實驗操作注意事項：儘管擴增序列的殘留汙染大部分是假陽性反應的原因，樣品間的交叉汙染也是原因之一。因此，不僅要在進行擴增反應是謹慎認真，在樣品的收集、抽提和擴增的所有環節都應該注意：
(1)戴一次性手套，若不小心濺上反應液，立即更換手套。
(2)使用一次性吸頭，嚴禁與pcr產物分析室的吸頭混用，吸頭不要長時間暴露於空氣中，避免氣溶膠的汙染。
(3)避免反應液飛濺，開啟反應管時為避免此種情況，開蓋前稍離心收集液體於管底。若不小心濺到手套或桌面上，應立刻更換手套並用稀酸擦拭桌面。
(4)操作多份樣品時，製備反應混合液，先將dntp、緩衝液、引物和酶混合好，然後分裝，這樣即可以減少操作，避免汙染，又可以增加反應的精確度。
(5)最後加入反應模板，加入後蓋緊反應管。
(6)操作時設立陰陽性對照和空白對照，即可驗證pcr反應的可靠性，又可以協助判斷擴增系統的可信性。
(7)儘可能用可替換或可高壓處理的加樣器，由於加樣器最容易受產物氣溶膠或標本dna的汙染，最好使用可替換或高壓處理的加樣器。如沒有這種特殊的加樣器，至少pcr操作過程中加樣器應該專用，不能交叉使用，尤其是pcr產物分析所用加樣器不能拿到其它兩個區。
(8)重複實驗，驗證結果，慎下結論。
6樓：
biog-qpcr反應靈敏性高，模板量的準確性對結果影響很大，建議將模板適度稀釋後加入，或用50ul反應體系。模板體積最好不超過反應體積的10%，操作儘量在超淨臺中進行，以防氣溶膠汙染。擴增產物長度選擇在100bp-500bp範圍內，最好為100-200bp。
配製反應體系時，避免**混勻，以防氣泡產生。反應條件：95℃加熱6-10分鐘，以啟用熱啟動dna聚合酶，然後95℃ 5-15秒，55-60℃ 30-60秒，40-45個迴圈。
反應條件可根據目標片段的大小、引物的tm值等適當調整。
pcr需要注意的問題
7樓：春素小皙化妝品
1、pcr產物的電泳檢測時間：一般為48h以內，有些最好於當日電泳檢測，大於48h後帶型不規則甚至消失。
2、假陰性，不出現擴增條帶
模板：模板中含有雜蛋白質，模板中含有taq酶抑制劑，模板中蛋白質沒有消化除淨，特別是染色體中的組蛋白，在提取製備模板時丟失過多，或吸入酚。
模板核酸變性不徹底。在酶和引物***時，不出現擴增帶，極有可能是標本的消化處理，模板核酸提取過程出了毛病，因而要配製有效而穩定的消化處理液，其程式亦應 固定不宜隨意更改。
酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而 導致假陰性。需注意的是有時忘加taq酶或溴乙錠。
引物：引物質量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱，是pcr失敗或擴增條帶不 理想、容易彌散的常見原因。有些批號的引物合成質量有問題，兩條引物一條濃度高，一條濃度低，造成低效率的不對稱擴增。
對策為：選定一個好的引物合成單位。引物的濃度不僅要看od值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現，而且兩引物帶的亮度應大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無條帶，此時做pcr有可能失敗，應和引物合成單位協商解決。
如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時要平衡其濃度。引物應高濃度小量分裝儲存，防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分，導致引物變質降解失效。引物設計不合理，如引物長度不夠，引物之間形成二聚體等。
mg2+濃度：mg2+離子濃度對pcr擴增效率影響很大，濃度過高可降低pcr擴增的特 異性，濃度過低則影響pcr擴增產量甚至使pcr擴增失敗而不出擴增條帶。
反應體積的改變：通常進行pcr擴增採用的體積為20ul、30ul、50ul。或100ul，應用多大體積進行pcr擴增，是根據科研和臨床檢測不同目的而設定，在做小體積如20ul 後，再做大體積時，一定要模索條件，否則容易失敗。
靶序列變異：如靶序列發生突變或缺失，影響引物與模板特異性結合，或因靶序列某 段缺失使引物與模板失去互補序列，其pcr擴增是不會成功的。
3、假陽性
出現的pcr擴增條帶與目的靶序列條帶一致，有時其條帶更整齊，亮度更高。
引物設計不合適：選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性，因而在進行pcr擴增時，擴增出的pcr產物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現假陽性。需重新設計引物。
靶序列或擴增產物的交叉汙染：這種汙染有兩種原因：一是整個基因組或大片段的交叉汙染，導致假陽性。
這種假陽性可用以下方法解決：操作時應小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內或濺出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質外，所有試劑或器材均應高壓消毒。
所用離心管及樣進槍頭等均應一次性使用。必要時，在加標本前，反應管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸汙染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。
可互相拼接，與引物互補後，可擴增出pcr產物，而導致假陽性的產生，可用巢式pcr方法來減輕或消除。
4、出現非特異性擴增帶
pcr擴增後出現的條帶與預計的大小不一致，或大或小，或者同時出現特異性擴增帶與非特異性擴增帶。非特異性條帶的出現，其原因：一是引物與靶序列不完全互補、或引物聚合形成二聚體。
二是mg2+離子濃度過高、退火溫度過低，及pcr迴圈次數過多有關。
其次是酶的質和量，往往一些**的酶易出現非特異條帶而另一**的酶則不出現，酶量過多有時也會出現非特異性擴增。其對策有：必要時重新設計引 物。
減低酶量或調換另一**的酶。降低引物量，適當增加模板量，減少迴圈次數。
5、出現片狀拖帶或塗抹帶
pcr擴增有時出現塗抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由於酶量過多或酶的質量 差，dntp濃度過高，mg2+濃度過高，退火溫度過低，迴圈次數過多引起。其對策有：
減少酶量，或調換另一**的酶。減少dntp的濃度。適當降低mg2+濃 度。
增加模板量，減少迴圈次數。
8樓：河傳楊穎
實驗操作注意事項：儘管擴增序列的殘留汙染大部分是假陽性反應的原因，樣品間的交叉汙染也是原因之一。因此，不僅要在進行擴增反應是謹慎認真，在樣品的收集、抽提和擴增的所有環節都應該注意：
1、戴一次性手套，若不小心濺上反應液，立即更換手套。
2、使用一次性吸頭，嚴禁與pcr產物分析室的吸頭混用，吸頭不要長時間暴露於空氣中，避免氣溶膠的汙染。
3、避免反應液飛濺，開啟反應管時為避免此種情況，開蓋前稍離心收集液體於管底。若不小心濺到手套或桌面上，應立刻更換手套並用稀酸擦拭桌面。
4、操作多份樣品時，製備反應混合液，先將dntp、緩衝液、引物和酶混合好，然後分裝，這樣即可以減少操作，避免汙染，又可以增加反應的精確度。
cr由變性→退火→延伸三個基本反應構成：
1、模板dna的變性：模板dna經加熱至93℃左右一定時間後，使模板dna雙鏈或經pcr擴增形成的雙鏈dna解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備。
2、模板dna與引物的退火（復性）：模板dna經加熱變性成單鏈後，溫度降至55℃左右，引物與模板dna單鏈的互補序列配對結合。
3、引物的延伸：dna模板--引物結合物在72℃、dna聚合酶（如taqdna聚合酶）的作用下，以dntp為反應原料，靶序列為模板，按鹼基互補配對與半保留複製原理，合成一條新的與模板dna鏈互補的半保留複製鏈。
用絕緣棒操作時，有哪些注意事項？
1 一副絕緣棒一般由三節組巧敏成。存放或攜帶時，應把各節分解後再將其外露絲扣一端朝上裝入特別的專用工具袋中，以防杆體表面擦傷或絲扣損壞。2 存放時要選擇通風良好 清潔乾燥的地方，並懸空平方在特質的閘杆架上，由專人管理。不應讓絕緣板與牆壁接觸，以免受潮。3 一旦絕緣棒表面損傷或受潮，應及時處理和乾燥。...
實驗室操作時，應該注意哪些安全事項
實驗室安全注意事項 1.進入實驗室開始工作前應瞭解煤氣總閥門 水閥門及電閘所在處。離開實驗室時，一定要將室內檢查一遍，應將水 電 煤氣的開關關好，門窗鎖好。2.使用煤氣燈時，應先將火柴點燃，一手執火柴緊靠近燈口，一手慢開煤氣門。不能先開煤氣門，後燃火柴。燈焰大小和火力強弱，應根據實驗的需要來調節。用...
小型純淨水裝置操作時有哪些注意事項
純淨水是用自來水為原料，通過離子交換 反滲透 蒸餾等工藝製成。硬度低，幾乎不含礦物質，燒開 後無水垢。礦泉水是從地下深處自然湧出或鑽井採集的，對水源地有嚴格要求，需經過地礦部門勘探評價，採取水 源地保護措施。礦泉水的 相對較高，主要是因為水源成本高，而不是因為其中微量的礦物質真有什 麼神奇的功效。礦...