1樓：望塵
選用管家基因作為內參基因，是因為內參基因在人組織和細胞中表達相對恆定。在檢測組織中基因的相對錶達量時，內參基因作為內部參照，可以校證實驗操作過程中產生的誤差。
什麼是實時熒光定量pcr？有什麼作用？請詳細說明。
2樓：月光_傾城
好多生物工作做廣告做培訓噢。你怎麼不去看一下。
pcr的原理是什麼
3樓：凱是凱喵的凱
pcr（聚合酶鏈式反應）技術的基本原理類似於dna的天然複製過程，其特異性依賴於與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。pcr由變性→退火→延伸三個基本反應步驟構成：
①模板dna的變性：模板dna經加熱至93℃左右一定時間後，使模板dna雙鏈或經pcr擴增形成的雙鏈dna解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備。
②模板dna與引物的退火（復性）：模板dna經加熱變性成單鏈後，溫度降至55℃左右，引物與模板dna單鏈的互補序列配對結合。
③引物的延伸：dna模板--引物結合物在72℃、dna聚合酶（如taqdna聚合酶）的作用下，以dntp為反應原料，靶序列為模板，按鹼基互補配對與半保留複製原理，合成一條新的與模板dna鏈互補的半保留複製鏈。
重複迴圈變性→退火→延伸三過程就可獲得更多的「半保留複製鏈」，而且這種新鏈又可成為下次迴圈的模板。每完成一個迴圈需2～4分鐘，2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。
4樓：demon陌
pcr原理：
dna的半保留複製是生物進化和傳代的重要途徑。雙鏈dna在多種酶的作用下可以變性解旋成單鏈，在dna聚合酶的參與下，根據鹼基互補配對原則複製成同樣的兩分子拷貝。
pcr技術的基本原理類似於dna的天然複製過程，其特異性依賴於與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。
pcr由變性--退火--延伸三個基本反應步驟構成：
①模板dna的變性：模板dna經加熱至93℃左右一定時間後，使模板dna雙鏈或經pcr擴增形成的雙鏈dna解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備；
②模板dna與引物的退火（復性）：模板dna經加熱變性成單鏈後，溫度降至55℃左右，引物與模板dna單鏈的互補序列配對結合；
③引物的延伸：dna模板--引物結合物在72℃、dna聚合酶（如taqdna聚合酶）的作用下，以dntp為反應原料，靶序列為模板，按鹼基互補配對與半保留複製原理，合成一條新的與模板dna鏈互補的半保留複製鏈。
重複迴圈變性--退火--延伸三過程就可獲得更多的「半保留複製鏈」，而且這種新鏈又可成為下次迴圈的模板。每完成一個迴圈需2～4分鐘，2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。
5樓：次次次蛋黃米亞
pcr技術的基本原理：
該技術是在模板dna、引物和四種脫氧核糖核苷酸存在下，依靠於dna聚合酶的酶促合成反應。dna聚合酶以單鏈dna為模板，藉助一小段雙鏈dna來啟動合成，通過一個或兩個人工合成的寡核苷酸引物與單鏈dna模板中的一段互補序列結合，形成部分雙鏈。
在適宜的溫度和環境下，dna聚合酶將脫氧單核苷酸加到引物3´-oh末端，並以此為起始點，沿模板5´→3´方向延伸，合成一條新的dna互補鏈。
6樓：恏乄亖
pcr的原理：
該技術是在模板dna、引物和四種脫氧核糖核苷酸存在下，依賴於dna聚合酶的酶促合成反應。dna聚合酶以單鏈dna為模板，藉助一小段雙鏈dna來啟動合成，通過一個或兩個人工合成的寡核苷酸引物與單鏈dna模板中的一段互補序列結合，形成部分雙鏈。在適宜的溫度和環境下，dna聚合酶將脫氧單核苷酸加到引物3´-oh末端，並以此為起始點，沿模板5´→3´方向延伸，合成一條新的dna互補鏈。
拓展資料：
聚合酶鏈式反應是一種用於放大擴增特定的dn**段的分子生物學技術，它可看作是生物體外的特殊dna複製，pcr的最大特點，是能將微量的dna大幅增加。因此，無論是化石中的古生物、歷史人物的殘骸，還是幾十年前**案中**所遺留的毛髮、**或血液，只要能分離出一丁點的dna，就能用pcr加以放大，進行比對。這也是「微量證據」的威力之所在。
7樓：就是月醬
pcr(聚合酶鏈式反應)是利用dna在體外攝氏95°高溫時變性會變成單鏈，低溫(經常是60°c左右)時引物與單鏈按鹼基互補配對的原則結合，再調溫度至dna聚合酶最適反應溫度(72°c左右)，dna聚合酶沿著磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互補鏈。基於聚合酶製造的pcr儀實際就是一個溫控裝置，能在變性溫度，復性溫度，延伸溫度之間很好地進行控制。
知識拓展：
聚合酶鏈式反應是一種用於放大擴增特定的dn**段的分子生物學技術，它可看作是生物體外的特殊dna複製，pcr的最大特點，是能將微量的dna大幅增加。因此，無論是化石中的古生物、歷史人物的殘骸，還是幾十年前**案中**所遺留的毛髮、**或血液，只要能分離出一丁點的dna，就能用pcr加以放大，進行比對。
這也是"微量證據"的威力之所在。由2023年美國mullis首先提出設想，2023年由其發明了聚合酶鏈反應，即簡易dna擴增法，意味著pcr技術的真正誕生。到如今2023年，pcr已發展到第三代技術。
1973 年，臺籍科學家錢嘉韻，發現了穩定的taq dna聚合酶，為pcr技術發展也做出了基礎性貢獻。
8樓：薄荷
聚合酶鏈式反應（英文：polymerase chain reaction，縮寫：pcr），是一種分子生物學技術，用於擴增特定的dn**段，這種方法可在生物體外進行，不必依賴大腸桿菌或酵母菌等生物體。
這種方法由凱利·穆利斯（kary mullis）於2023年開發，當時他是cetus公司的僱員，也是2023年諾貝爾化學獎的獲得者，它是一種簡單，廉價和可靠的方法複製dn**段，這個概念適用於現代生物學和相關科學的許多領域。 pcr可能是分子生物學中使用最廣泛的技術。這種技術被用於生物醫學研究，犯罪取證和分子考古學 。
拓展資料：
微生物複製是一個費時耗力的流程，首先要將dna經限制酶剪裁，再利用連線酶（ligase）加到載體（vector）中，之後利用瞬間電擊（electroporation）或是熱休克（heat shock）的方式，送到大腸桿菌感受態細胞（competent cell）中，將此菌於培養皿大量繁殖培養，再經過繁複的分離、純化過程，時間通常需要近一週，才能大量複製片段。
所以僅需一小時的pcr能節省大量時間和繁複的操作，聚合酶鏈式反應技術被廣泛地運用在醫學和生物學的實驗室，例如用於判斷檢體中是否會表現某遺傳疾病的圖譜、傳染病的診斷、基因複製，以及親子鑑定。
9樓：北京索萊寶科技****
pcr技術必須有人工合成的合理引物和提取的樣品dna,然後才進行自動熱迴圈,最後進行產物鑑定與分析.引物設計與合成目前只能在少數技術力量較強的研究院、所進行,臨床應用只需購買pcr檢測試劑盒就可開展工作,pcr自動熱迴圈中影響因素很多,對不同的dna樣品,pcr反應中各種成份加入量和溫度迴圈引數均不一致.現將幾種主要影響因素介紹如下.
一、溫度迴圈引數
在pcr自動熱迴圈中,最關鍵的因素是變性與退火的溫度.如操作範例所示,其變性、退火、延伸的條件是：94℃60s, 37℃60s, 72℃120s,共25～30個迴圈,擴增片段500bp.
在這裡,每一步的時間應從反應混合液達到所要求的溫度後開始計算.在自動熱迴圈儀內由混合液原溫度變至所要求溫度的時間需要30～60s,這一遲滯時間的長短取決於幾個因素,包括反應管型別、壁厚、反應混合液體積、熱源（水浴或加熱塊）以及兩步驟間的溫度差,在設定熱迴圈時應充分給以重視和考慮,對每一儀器均應進行實測.
關於熱迴圈時間的另一個重要考慮是兩條引物之間的距離；距離越遠,合成靶序列全長所需的時間也越長,前文給出的反應時間是按最適於合成長度500bp的靶序列擬定的.下面就各種溫度的選擇作一介紹.
1．模板變性溫度變性溫度是決定pcr反應中雙鏈dna解鏈的溫度,達不到變性溫度就不會產生單鏈dna模板,pcr也就不會啟動.變性溫度低則變性不完全,dna雙鏈會很快復性,因而減少產量.一般取90～95℃.
樣品一旦到達此溫度宜迅速冷卻到退火溫度.dna變性只需要幾秒種,時間過久沒有必要；反之,在高溫時間應儘量縮短,以保持taq dna聚合酶的活力,加入taq dna聚合酶後最高變性溫度不宜超過95℃.
2．引物退火溫度退火溫度決定pcr特異性與產量；溫度高特異性強,但過高則引物不能與模板牢固結合,dna擴增效率下降；溫度低產量高,但過低可造成引物與模板錯配,非特異性產物增加.一般先由37℃反應條件開始,設定一系列對照反應,以確定某一特定反應的最適退火溫度.也可根據引物的（g+c）%含量進行推測,把握試驗的起始點,一般試驗中退火溫度ta(annealing temperature)比擴增引物的融解溫度ttm(melting temperature)低5℃,可按公式進行計算：
ta = tm - 5℃= 4(g+c)+ 2(a+t) -5℃
其中a,t,g,c分別表示相應鹼基的個數.例如,20個鹼基的引物,如果（g+c）%含量為50%時,則ta的起點可設在55℃.在典型的引物濃度時（如0.
2μmol/l）,退火反應數秒即可完成,長時間退火沒有必要.
3．引物延伸溫度溫度的選擇取決於taq dna聚合酶的最適溫度.一般取70～75℃,在72℃時酶催化核苷酸的標準速率可達35～100個核苷酸/秒.每分鐘可延伸1kb的長度,其速度取決於緩衝溶液的組成、ph值、鹽濃度與dna模板的性質.
擴增片段如短於150bp,則可省略延伸這一步,而成為雙溫迴圈,因taq dna聚合酶在退火溫度下足以完成短序列的合成.對於100～300bp之間的短序列片段,採用快速、簡便的雙溫迴圈是行之有效的.此時,引物延伸溫度與退火溫度相同.
對於1kb以上的dn**段,可根據片段長度將延伸時間控制在1～7min,與此同時,在pcr緩衝液中需加入明膠或bsa試劑,使taq dna聚合酶在長時間內保持良好的活性與穩定性；15%～20%的甘油有助於擴增2.5kb左右或較長dn**段.
4．迴圈次數常規pcr一般為25～40個週期.一般的錯誤是迴圈次數過多,非特異性背景嚴重,複雜度增加.當然迴圈反應的次數太少,則產率偏低.
所以,在保證產物得率前提下,應儘量減少迴圈次數.
擴增結束後,樣品冷卻並置4℃儲存.
二、引物引物設計
要擴增模板dna,首先要設計兩條寡核苷酸引物,所謂引物,實際上就是兩段與待擴增靶dna序列互補的寡核苷酸片段,兩引物間距離決定擴增片段的長度,兩引物的5』端決定擴增產物的兩個5』末端位置.由此可見,引物是決定pcr擴增片段長度、位置和結果的關鍵,引物設計也就更為重要.
引物設計的必要條件是與引物互補的靶dna序列必須是已知的,兩引物之間的序列未必清楚,這兩段已知序列一般為15～20個鹼基,可以用dna合成儀合成與其對應互補的二條引物,除此之外,引物設計一般遵循的原則包括：
1．引物長度根據統計學計算,長約17個鹼基的寡核苷酸序列在人的基因組中可能出現的機率的為1次.因此,引物長度一般最低不少於16個核苷酸,而最高不超過30個核苷酸,最佳長度為20～24個核苷酸.這樣短的寡核苷酸在聚合反應溫度（通過72℃）下不會形成穩定的雜合體.
有時可在5』端新增不與模板互補的序列,如限制性酶切位點或啟動因子等,以完成基因克隆和其他特殊需要；引物5』端生物素標記或熒游標記可用於微生物檢測等各種目的.
有時引物不起作用,理由不明,可移動位置來解決.
2．（g+c）%含量引物的組成應均勻,儘量避免含有相同的鹼基多聚體.兩個引物中（g+c）%含量應儘量相似,在已知擴增片段（g+c）%含量時宜接近於待擴增片段,一般以40%～60%為佳.
3．引物內部應避免內部形成明顯的次級結構,尤其是髮夾結構（hairpin structures）.例如：
4．引物之間兩個引物之間不應發生互補,特別是在引物3』端,即使無法避免,其3』端互補鹼基也不應大於2個鹼基,否則易生成「引物二聚體」或「引物二倍體」（primer dimer）.所謂引物二聚體實質上是在dna聚合酶作用下,一條引物在另一條引物序列上進行延伸所形成的與二條引物長度相近的雙鏈dn**段,是pcr常見的副產品,有時甚至成為主要產物.
另外,兩條引物之間避免有同源序列,尤為連續6個以上相同鹼基的寡核苷酸片段,否則兩條引物會相互競爭模板的同一位點；同樣,引物與待擴增靶dna或樣品dna的其它序列也不能存在6個以上鹼基的同源序列.否則,引物就會與其它位點結合,使特異擴增減少,非特異擴增增加.
5．引物3』端配對dna聚合酶是在引物3』端新增單核苷酸,所以,引物3』端5～6個鹼基與靶dna的配對要求必須精確和嚴格,這樣才能保證pcr有效擴增.
引物設計是否合理可用pcrdesn軟體和美國primer軟體進行計算機檢索來核定.
人工合成的寡核苷酸引於最好經過色譜（層析）純化或page純化,以除去未能合成至全長的短鏈等雜質.純化引物在25%乙腈溶液中4℃儲存可阻止微生物的生長；一般情況下,不用的引物應儲存在-20℃冰箱中,在液體中引物能儲存6個月,凍幹後可儲存1～2年.
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