1樓：好卡哇伊噢嘿
根據曲線初步判斷，整個實驗設計還可以！你做相對定量嗎，將樣品結果與對照看看基因表達量分析就可以了！ 如果絕對定量，需要進一步實驗吧！
請問：實時熒光定量pcr怎樣設定才能有溶解曲線？
2樓：匿名使用者
有一種可能是，在試驗開始的設定階段，需要為整個實驗設計出熔解曲線的程式，這個您可能忘記了。
3樓：匿名使用者
在設定反應程式時，在最後加一步
怎麼理解熒光定量pcr的溶解曲線
4樓：匿名使用者
熒光定量pcr的溶解曲線理解：用syber green方法做完pcr後，用來判斷產物是否相對專一。應結束後，逐漸加溫。和syber
green分子結合的pcr產物隨溫度升高逐漸變為單鏈，就不能在和syber
green結合。
一般每加溫一度，讀一次訊號。當溫度到達pcr產物的tm時，產物解離一下增多。曲線的橫座標是溫度，而縱座標是熒光訊號的變化，開始加熱，訊號變化不大，所以幾乎是平的。
接近tm時，突然變化加大，所以出現峰值。再升溫，產物全部解離，就又是一條直線了。如果有非特異性產物，在加熱過程中就會出現一些比較矮，寬的峰。
5樓：匿名使用者
這個一般是用syby green作為熒光染料的時候需要做的工作！
因為syby green染料是非特異的染料，只要有擴增，染料就可以鑲嵌在雙鏈中發出熒光。我們做溶解曲線是為了觀察我們擴增發出熒光的片段是不是我們需要的產物。如果溶解曲線做出來只有單峰，且出鋒位置是你的退火溫度，那麼這個是你的產物發出的熒光，實驗結果有效。
如果出現多鋒或退火溫度不對，那麼這個實驗結果是不可信的！你需要再次調整！
請問我這個實時熒光定量pcr融解曲線為什麼是從負值開始的？結果可用嗎？
6樓：分子達人
看這個結果有幾個猜想：
1)如果之前做實驗的時候，儀器沒有出現過這種情況，有可能是儀器出現錯誤，建議重啟一下，或者改軟體需要重新校準一下。
2)從這個結果來看，引物應該是可以用的，主峰也只有一個，特異性還是有的，不過還要參考一下擴增曲線，ct值如果在35個迴圈以內，應該是沒有問題的。
如何設定溶解曲線？
7樓：向天致信
一，理解做「溶解曲線」的意義：
普通pcr的擴增產物通過電泳跑膠的方式來區分目的產物和非目的產物（引物二聚體、非特異性擴增產物）。
而且當從高濃度到低濃度做梯度實驗時，我們從電泳圖上往往可以看到3個結果：
1 全部目的產物
2 部分目的產物，部分非特異產物（比目的產物大或者小）
3 全部非特異產物
熒光染料是dna雙鏈小溝結合物，本身不具有選擇性，能和所有的dna雙鏈結合。
在熒光pcr染料法裡，我們單單通過pcr熒光擴增曲線來「判斷」結果是否合適？
顯然，單從熒光擴增曲線來「判斷」結果是不合適的。
因為，非特異性擴增產物也能與染料結合，s型的熒光擴增曲線中有區域性or全部的熒光來自非特異擴增的「貢獻」。
鑑定並區分目的產物與非特異產物
顯然，需要通過溶解曲線。
雙鏈dna都有自己的tm值。可以通過tm值的不同，將不同的產物分開。
在熒光pcr中，大多擴增100bp左右的產物（最好不超過200bp），退火和延伸時間較短。非特異的產物基本上都比目的擴增片段小。
所以，在做溶解曲線分析時，目的片段的tm值較大，而非特異的tm值較小。
二 降溫速率
普通熒光pcr儀的降溫速度預設是：1℃/cycle，能做hrm的儀器，降溫速度可設定為<1℃/cycle。
一般來說，不做hrm，就設定1℃/cycle即可滿足需要。
三 溫度區間
理論上來說，能包含住產物tm值和非特異產物tm值即可。
所以，一般設定在50℃-95℃區間內均可。
四 熒光采集時間
若出於節省時間的考慮，用5s都可以有比較不錯的結果。
8樓：匿名使用者
博凌科為-為你解答：我們用的是系統預設的模式，95度一分鐘，55度半分鐘，95度半分鐘
熒光定量pcr儀 stepone plus的功率是多少
9樓：無名獵手
沒條件去實驗室看，這是目前網上能查到的，僅供參考。
樣本升降
溫速率 快速模內式：+／–
容 2.2℃／秒 標準模式：+/–1.6℃／秒加熱塊最高升降溫速率 4.6℃／秒
溫度範圍 4℃／秒-100℃／秒
溫度精確度 設定值／顯示溫度的土0.25℃(35℃至95℃)(時鐘啟動後3分鐘 開始測量)
溫度均一性 士0.50℃(時鐘啟動後30秒)，溫度範圍35℃至95℃解鏈曲線解析度 低至0.1℃
執行時間 快速：使用taqman®rnasep驗證測試反應板，40迴圈pcr反應耗時不足40分鐘；標準：40迴圈pcr反應耗時不足2小時
熒光定量pcr熔解曲線
10樓：匿名使用者
溶解曲線是在正常的pcr反應基礎上加一個溶解曲線的反應條件，其中當溫度由60℃升至95℃時，pcr儀每隔一定的溫度檢測一次訊號。最後將收集的訊號繪製出溶解曲線，然後將溶解曲線一次微分就會得到我們平時看到的峰性圖。每一條線代表著某個孔裡的反應體系裡產物的單一情況，某一條線如果為單峰且在一定合理的溫度範圍內（一般為80~90℃）則認為正常，如果為雙峰則可能有非特異性擴增。
由此可以判斷產物是否為目的基因且是否單一。內參有內參的線，目的基因有目的基因的線，同一條線不會出現兩個基因的峰。你可以看一下溶解曲線的橫、縱座標。
11樓：烏冬蛋白
內參量多，迴圈數少吧，我也不熟
第一次做熒光定量pcr，內參基因能夠跑出來，而且溶解曲線也比較好，但是目的基因完全跑不出來
12樓：匿名使用者
問題有可能如下
bai：
1） 模板du製備有問題。你可以用普通
zhipcr擴增，然後dao電泳確定是不是專模板有問題？
2） 引物問屬題：引物設計的好與否，對realtime 結果至關重要！ 可以用普通pcr確定你的引物擴增效率如何？ 模板可以選取一個陽性質粒當模板。
3） realtime 體系配置出問題：好好想一下，該加的東西都加了沒？模板、染料、taq酶、等。
並且各個試劑的量一定要確定沒問題！
4） 程式設定：儀器的程式設定，plate的編排、退火溫度、等等。
祝你好運！！！
13樓：匿名使用者
沒有學過，高中化學也很差，所以，不知道！！！
抱歉啊，幫不了你！！！
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