1樓：匿名使用者
一步法細菌活性蛋白提取試劑採用一種溫和的可以通過透析去除的,破裂細菌細胞，溶解蛋白，而不會產生變性的非離子型去汙試劑從大腸桿菌中提取可溶性蛋白，不需要超聲等機械細胞破碎方法，該試劑可以從細菌裂解液中提取可溶性蛋白和**包涵體蛋白，而且提取效率要高於超聲等機械細胞破碎方法，提取的可以溶性蛋白可以直接用於電泳，免疫共沉澱，蛋白質絞鏈，標記，pull down ，emsa，酶免分析 (western blot, elisa, ria)等實驗。
真核原核表達系統的優缺點？
2樓：華重樓
原核表達系統
表達調控方式
組成型,誘導型
表達產物定位
分泌型,不分泌型(細胞內,細胞膜,周質空間)
產物純化方式
是否融合蛋白,是否一步親和純化
產物溶解狀況
可溶,包含體,分泌型
在各種表達系統中，最早被採用進行研究的是原核表達系統，這也是目前掌握最為成熟的表達系統。該項技術的主要方法是將已克隆入目的基因dn**段的載體(一般為質粒)轉化細菌(通常選用的是大腸桿菌)，通過iptg誘導並最終純化獲得所需的目的蛋白。其優點在於能夠在較短時間內獲得基因表達產物，而且所需的成本相對比較低廉。
但與此同時原核表達系統還存在許多難以克服的缺點：如通常使用的表達系統無法對錶達時間及表達水平進行調控，有些基因的持續表達可能會對宿主細胞產生毒害作用，過量表達可能導致非生理反應，目的蛋白常以包涵體形式表達，導致產物純化困難；而且原核表達系統翻譯後加工修飾體系不完善，表達產物的生物活性較低
為克服上述不足，許多學者將原核基因調控系統引入真核基因調控領域，其優點是
①根據原核生物蛋白與靶dna間作用的高度特異性設計，而靶dna與真核基因調控序列基本無同源性，故不存在基因的非特異性啟用或抑制
②能誘導基因高效表達，可達105倍，為其他系統所不及；
③能嚴格調控基因表達，即不僅可控制基因表達的「開關」，還可人為地調控基因表達量
因此，利用真核表達系統來表達目的蛋白越來越受到重視。目前，基因工程研究中常用的真核表達系統有酵母表達系統、昆蟲細胞表達系統和哺乳動物細胞表達系統。
2rt-pcr是將rna的反轉錄（rt）和cdna的聚合酶鏈式擴增（pcr）相結合的技術。首先經反轉錄酶的作用從rna合成 cdna，再以cdna為模板，擴增合成目的片段。rt-pcr技術靈敏而且用途廣泛，可用於檢測細胞中基因表達水平，細胞中rna病毒的含量和直接克隆特定基因的cdna序列。
作為模板的rna可以是總rna、mrna或體外轉錄的rna產物。無論使用何種rna，關鍵是確保rna中無rna酶和基因組dna的汙染。
rt-pcr是將rna的反轉錄（rt）和cdna的聚合酶鏈式擴增（pcr）相結合的技術。首先經反轉錄酶的作用從rna合成 cdna，再以cdna為模板，擴增合成目的片段。rt-pcr技術靈敏而且用途廣泛，可用於檢測細胞中基因表達水平，細胞中rna病毒的含量和直接克隆特定基因的cdna序列。
作為模板的rna可以是總rna、mrna或體外轉錄的rna產物。。rt-pcr用於對錶達資訊進行檢測或定量。另外，這項技術還可以用來檢測基因表達差異或不必構建cdna文庫克隆cdna。
rt-pcr比其他包括northern印跡、rnase保護分析、原位雜交及s1核酸酶分析在內的rna分析技術，更靈敏，更易於操作。逆轉錄反應可以使用逆轉錄酶，以隨機引物、oligo(dt)或基因特異性的引物（gsp）起始。rt-pcr可以一步法或兩步法的形式進行。
在兩步法rt-pcr中，每一步都在最佳條件下進行。cdna的合成首先在逆轉錄緩衝液中進行，然後取出1/10的反應產物進行pcr。在一步法rt-pcr中，逆轉錄和pcr在同時為逆轉錄和pcr優化的條件下，在一隻管中順次進行。
逆轉錄酶（reverse transcriptase）是存在於rna病毒體內的依賴rna的dna聚合酶，至少具有以下三種活性：
1、 依賴rna的dna聚合酶活性：以rna為模板合成cdna第一條鏈
2、 rnase水解活性：水解rna雜合體中的rna
3、 依賴dna的dna聚合酶活性：以第一條dna鏈為模板合成互補的雙鏈cdna
用於反轉錄的引物可視實驗的具體情況選擇隨機引物、oligo dt 及基因特異性引物中的一種。對於短的不具有髮卡結構的真核細胞mrna，三種都可。
實驗方法如下
3 質粒是染色體外能夠進行自主複製的遺傳單位，包括真核生物的細胞器和細菌細胞中染色體以外的脫氧核糖核酸(dna)分子。現在習慣上用來專指細菌、酵母菌和放線菌等生物中染色體以外的dna分子。在基因工程中質粒常被用做基因的載體。
許多細菌除了染色體外，還有大量很小的環狀dna分子，這就是質粒(pla**id)（補充：部分質粒為rna）。質粒上常有抗生素的抗性基因，例如，四環素抗性基因或卡那黴素抗性基因等。
有些質粒稱為附加體(episome)，這類質粒能夠整合進細菌的染色體，也能從整合位置上切離下來成為遊離於染色體外的dna分子。
目前，已發現有質粒的細菌有幾百種，已知的絕大多數的細菌質粒都是閉合環狀dna分子(簡稱cccdna)。細菌質粒的相對分子質量一般較小，約為細菌染色體的0.5%～3%。
根據相對分子質量的大小，大致上可以把質粒分成大小兩類：較大一類的相對分子質量是40×106以上，較小一類的相對分子質量是10×106以下(少數質粒的相對分子質量介於兩者之間)。每個細胞中的質粒數主要決定於質粒本身的複製特性。
按照複製性質，可以把質粒分為兩類：一類是嚴緊型質粒，當細胞染色體複製一次時，質粒也複製一次，每個細胞內只有1～2個質粒；另一類是鬆弛型質粒，當染色體複製停止後仍然能繼續複製，每一個細胞內一般有20個左右質粒。一般分子量較大的質粒屬嚴緊型。
分子量較小的質粒屬鬆弛型。質粒的複製有時和它們的宿主細胞有關，某些質粒在大腸桿菌內的複製屬嚴緊型，而在變形桿菌內則屬鬆弛型。
在基因工程中，常用人工構建的質粒作為載體。人工構建的質粒可以集多種有用的特徵於一體，如含多種單一酶切位點、抗生素耐藥性等。常用的人工質粒運載體有pbr322、psc101。
pbr322含有抗四環素基因(tcr)和抗氨苄青黴素基因(apr)，並含有5種內切酶的單一切點。如果將dn**段插入ecori切點，不會影響兩個抗生素基因的表達。但是如果將dn**段插入到hind iii、bam h i 或 sal i切點，就會使抗四環素基因失活。
這時，含有dna插入片段的pbr322將使宿主細菌抗氨苄青黴素，但對四環素敏感。沒有dna插入片段的pbr322會使宿主細菌既抗氨苄青黴素又抗四環素，而沒有pbr322質粒的細菌將對氨苄青黴素和四環素都敏感。psc101與pbr322相似，只是沒有抗氨苄青黴素基因和psti切點。
質粒運載體的最大插入片段約為10 kb(kb表示為千鹼基對)。
4 基因診斷（gene diagnosis）是以探測基因的存在，分析基因的型別和缺陷及其表達功能是否正常，從而達到診斷疾病的一種方法。它是繼形態學、生物化學和免疫學診斷之後的***診斷技術，它的誕生與發展得益於分子生物學理論和技術的迅速發展。
常用基因診斷技術：
一、southern印跡法（southern blot）
基本原理是：硝酸纖維膜或尼龍濾膜對單鏈dna的吸附能力很強，當電泳後凝膠經過dna變性處理，覆以上述濾膜，再於其上方壓上多層乾燥的吸水紙，藉助它對深鹽溶液的上吸作用，凝膠上的單鏈dna將轉移到濾膜上。轉移是原位的，即dn**段的位置保持不變。
轉移結束後，經過80℃烘烤的dna，將原位地固定於膜上。
當含有特定基因片段已原位轉移到膜上後，即可與同位素標記了的探針進行雜交，並將雜交的訊號顯示出來。雜交通常在塑料袋中進行，袋內放置上述雜交濾膜，加入含有變性後探針的雜交溶液後，在一定溫度下讓單鏈探針dna與固定於膜上的單鏈基因dna分子按鹼基到互補原理充分結合。結合是特異的，例如只有β珠蛋白基因dna才能結合上β珠蛋白的探針。
雜交後，洗去膜上的未組合的探針，將ⅹ線膠片覆於膜上，在暗盒中日光進行放射自顯影。結合了同位素標記探針的dn**段所在部位將顯示黑色的雜交帶，基因的缺失或突變則可能導致帶的缺失或位置改變。
二、聚合酶鏈反應
近年來，基因分析和基因工程技術有了革命性的突破，這主要歸功於聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction,pcr）的發展和應用。應用pcr技術可以使特定的基因或dn**段在短短的2－3小時內體外擴增數十萬至百萬倍。擴增的片段可以直接通過電泳觀察，也可用於進一步的分析。
這樣，少量的單拷貝基因不需通過同位素提高其敏感性來觀察，而通過擴增至百萬倍後直接觀察到，而且原先需要
一、二週才能作出的診斷可以縮短至數小時。
三、擴增片段長度多型性
小衛星dna和微衛星dna的長度多型性可以通過pcr擴增後電泳來檢出，並用於致病基因的連鎖分析，這種診斷方法稱為擴增片段長度多型性（amplified fragment length polymorphi**,amp-flp）連鎖分析法。pcr擴增後，產物即等位片段之間的差別有時只有幾個核苷酸，故需用聚丙烯醯胺凝膠電泳分離鑑定。此法多用於突變性質不明的連鎖分析.
四、等位基因的特異寡核苷酸探針診斷法
當基因的突變部位和性質已完全明瞭時，可以合成等基因特異的寡核苷酸探針（allele-specific oligonucleotide,aso）用同位素或非同位素標記進行診斷。探針通常為長20bp左右的核苷酸。用於探測點突變時一般需要合成兩種探針，與正常基因序列完全一致，能與之穩定地雜交，但不能與突變基因序列雜交；另一種與突變基因序列一致，能與突變基因序列穩定雜交，但不能與正常基因序列穩定雜交，這樣，就可以把只有一個鹼基發生了突變的基因區別開來.
pcr可結合aso，即pcr－aso技術，即先將含有突變點的基因有關片段進行體外擴增，然後再與aso探針作點雜交，這樣大大簡化了方法，節約了時間，而且只要極少量的基因組dna就可進行。
五、單鏈構象多型性診斷法
單鏈構象多型性（signle strand conformation polymorphi**,sscp）是指單鏈dna由於鹼基序列的不同可引起構象差異，這種差異將造成相同或相近長度的單鏈dna電泳遷移率不同，從而可用於dna中單個鹼基的替代、微小的缺失或手稿的檢測。用sscp法檢查基因突變時，通常在疑有突變的dn**段附近設計一對引物進行pcr擴增，然後將擴增物用甲醯胺等變性，並在聚丙烯醯胺凝膠中電泳，突變所引起的dna構象差異將表現為電泳帶位置的差異，從而可據之作出診斷。
原核載體與真核載體，原核表達載體和真核表達載體的區別
主要是因為原抄核和真核表達襲系統所需的表達元件不同。比如說啟動子，終止子在兩種表達系統中是不一樣的。帶有真核表達元件的是真核載體，能在真核生物內表達 帶有原核表達元件的是原核載體，能在原核生物內表達。兩者都具有的為穿梭載體。1 真核表達載體和原核表達載體就是能在真核生物或原核生物中表達的載體,它們一...
真核表達載體的特點，原核表達載體的特點
原核表達一般週期短，但蛋白的活性不能確定 真核表達經過糖基化，磷酸化，和目的蛋白相似性高，週期要長，往往有的還有養細胞 真核過表達質粒，原核過表達質粒的區別 急求 一 指代不同 1 真核過表達質粒 真核細胞表達載體之一為pegfp n1載體，具有對方面的優點。pegfp n1載體上攜帶有egfp蛋白...
原核生物與真核生物的基因表達有什麼不同
答 dna和染色體水bai平上的調du控 基因的拷貝zhi數擴增或丟失和dao基因重排回,dna修飾,在染色體答上的位置,染色體結構 包括染色質 異染色質 核小體 都可影響基因表達.轉錄水平上的調控 轉錄起始的控制和延伸的弱化對mrna前體的水平都會產生影響.轉錄後rna加工過程和運送中的調控 真核...